TEKNIK WHOLE MOUNT PADA PEMBUATAN SEDIAAN UTUH EMBRIO AYAM

Wholemount merupakan sediaan mikroteknik keseluruhan dari suatu objek yang diamati. Embrio ayam merupakan salah satu model tepat untuk teknik wholemount. 

Tahap persiapan

            Pada tahap ini terlebih dahulu ditentukan umur embrio ayam yang diinginkan yang sebaiknya berumur 24 jam, 33 jam, dan 48 jam. Objek yang digunakan untuk sediaan, dalam hal ini embrio ayam terlebih dahulu diinkubasi di dalam dalam inkubator pada suhu 39^oC atau 103^oF. Umur embrio ditentukan mulai jam ke-0 setelah telur dikeluarkan oleh induk.

            Pada tahap ini juga dilakukan pembuatan larutan yang dibutuhkan untuk pembuatan preparat. Adapun larutan yang dibutuhkan yaitu:

1.      Larutan fisiologis (salin) dengan suhu 39^o C.

2.      Larutan alkohol 70%-asam (HCl 0,1 % dalam alkohol 70%). Misalnya untuk membuat 100 ml larutan diferensiasi maka dibutuhkan 0,1 ml HCl diencerkan dalam alkohol 70% sebanyak 99,9 ml.

3.       Larutan fiksatif formol-nitrate. Larutan ini dibuat dengan perbandingan formalin 10% dan asam nitrate 10% sebesar 3: 1. Misalnya kita akan membuat 20 ml larutan formol-nitrate, maka dibutuhkan 15 ml larutan formalin 10% dan 5 ml asam nitrate 10%.

4.      Larutan fiksatif Bouin (pikro-sulfat). Larutan ini dibuat dengan komposisi asam pikrat jenuh sebanyak 75 ml, formalin 25 ml dan asam cuka glasial 5 ml. Larutan ini dapat digunakan untuk jaringan hewan maupun tumbuhan. Objek dapat disimpan lama didalam larutan fiksatif ini dan tidak rusak selama mengeras.

Larutan fiksatif yang digunakan berfungsi untuk mematikan sel-sel dalam jaringan tanpa merusak bentuk dan struktur jaringan tersebut, melindungi jaringan dari larutan yang diberikan selanjutnya, menunjukkan perubahan yang disebabkan oleh diferensiasi optik karena pergantian indeks bias dan membuat sel-sel dalam jaringan keras.

Untuk pewarnaan embrio ayam digunakan hematoxylin Delafield. Larutan ini merupakan larutan yang kuat dan harus diencerkan dengan aquadest dengan perbandingan 1:1 atau 1:2. Pewarnaan ini menghasilkan warna biru setelah dicuci dengan air kran yang mengandung lithium karbonat. Adapun komposisi dari pewarna ini adalah aquadest 100 ml, amonium alum 20 gram, alkohol absolut 10 ml, gliserin 25 ml, metanol 25 ml, dan hematoxylin 1 gram. Cara pembuatannya yaitu:

Ø  Menjenuhkan 100 ml aquadest dengan 20 gram amonium alum (= amonium alumunium sulfat).

Ø  Melarutkan 1 gram hematoxylin ke dalam 10 ml alkohol absolut.

Ø  Menambahkan larutan hematoxylin tersebut setetes demi setetes ke dalam larutan alum (butir 1)

Ø  Menempatkan larutan tersebut didalam botol yang berleher sempit dan membiarkan botol tersebut tanpa tutup dipanas matahari selama beberapa minggu (waktu yang baik sekitar 6 minggu dan tidak lebih dari 2 bulan, sampai masak).

Ø  Apabila sudah masak, menyaring larutan tersebut dengan kertas filter dan menambahkan 25 ml gliserin dan 25 ml metanol.

Ø  Pada hari berikutnya larutan tersebut disaring dengan kertas filter kemudian menyimpannya dalam botol dan ditutup rapat.

Tahap Pembuatan Sediaan

Telur ayam fertil ayam kampung yang telah diinkubasi dipecah

Dimasukkan ke dalam larutan fisiologis 100 ml dengan suhu 39^oC

 

Meneteskan larutan fiksatif formol-nitrate (20 menit)

Menggunting tepi luar embrio dan membersihkan selaput vitelin serta yolk

 Meletakkan embrio di kaca arloji yang berisi aquadest dan direntangkan

Membuat lubang bundar yang lebih besar dari embrio pada kertas saring

Meletakkan kertas saring diatas embrio, sehingga bagian kiri dan kanan dan sekitar embrio menempel pada kertas saring

Merendam embrio dalam larutan fiksatif pikro-sulfat dan larutan Bouin selama

6-24 jam

Cuci dengan alkohol 70% sampai warna fiksatif hilang

 

Merendam embrio dalam alkohol 50%, 30%, masing-masing 30 menit

 

Merendam dalam aquades selama 30 menit

 

Mewarnai sediaan dengan hematoxylin delafield selama 1 malam

Diferensiasi menggunakan alkohol 70%-asam (HCl 0,1% dalam alkohol 70%), hingga anatomi dalam nampak jelas.

 

Mencuci dengan air kran yang mengandung Lithium Karbonat sampai berwarna biru.

Dehidrasi menggunakan alkohol 50%, 70%, 95% dan 100%, masing-masing selama 10-15 menit

 

Melepaskan embrio dari kertas saring dan menjernihkannya dalam terpineal selama 10-15 menit.

Melekatkan preparat didalam balsam

Setelah kita mendapatkan telur ayam dengan berbagai usia yang kita inginkan dan kita rawat di dalam kondisi yang sesuai di dalam inkubator, maka langkah selanjutnya adalah mendapatkan embrio ayam serta memberikan beberapa perlakuan untuk mendapatkan sediaan embrio ayam yang bagus. Langkah awal yaitu memecah telur ayam dengan hati-hati dan memisahkan embrio ayam tersebut dari masa telur lainnya. Untuk memecah telur tersebut digunakan pisau dan dengan hati- hati memecah telur tersebut. Kemudian meletakkan seluruh isi telur pada bejana/ wadah/ mangkok yang berisi larutan fisiologis (salin) sebanyak 100 ml yaitu sampai seluruh masa telur dapat terendam pada suhu yang hangat sekitar 39⁰C untuk proses pembersihan. Larutan fisiologis ini berfungsi untuk menjaga keadaan sel embrio agar tetap hidup selama kita membersihkan embrio dari masa sel lain dan selaput- selaput yang melindungi embrio. Sedangkan suhu 39⁰C larutan fisiologis tersebut memberikan kondisi yang sesuai untuk kehidupan embrio dan sama dengan suhu selama inkubasi. Dengan larutan fisiologis tersebut, embrio akan terletak di bagian atas pada larutan, karena larutan garam fisiologis menyerap masa sel lain seperti albumin dan kuning telur dan memudahkan kita untuk memisahkan embrio dari masa telur tersebut.

Setelah embrio ayam cukup bersih dari masa telur yang lain kemudian dilanjutkan dengan proses fiksasi dengan menggunakan larutana fiksatif formol-nitrat pada embrio selama krang lebh 20 menit. Fiksasi merupakan tahap permulaan yang penting dalam pembuatan sediaan. Adapun tujuan fiksasi adalah untuk mematikan sel- sel dalam jaringan tanpa merusak bentuk dan struktur- strukturnya, melindungi kehancuran  dari larutan-larutan berikutnya dan menunjukkan perubahan yang disebabkan oleh diferensiasi optik karena pengantian indeks bisa serta membuat sel- sel dalam jaringan menjadi keras. Dengan adanya proses fiksatif ini akan menudahkan kita untuk melakukan pewarnaan dan perlakuan lebih lanjut karena organ tidak lunak lagi.

Setelah proses fisasi embrio, selanjutnya embrio ayam tersebut dibersihkan dari sisa- sisa selaput yang kemungkinan masih menempel pada embrio, seperti selaput vitelin dan kuning telur yang masih tertinggal dengan dari pengguntingan dalam larutan aquades. Kemudian merentangkan embrio ayam agar tidak ada bagian yang berkerut. Kemudian membuat lobang pada kertas saring berukuran lebih besar dari embrio ayam kemudian meletakkan kertas saring tersebut di atas embrio sehingga bagian kiri dan kanan serta sekitar embrio menempel pada kertas saring. Proses selanjutnya dlanjutkan dengan fiksasi dengan pikro-sulfat atau larrutan Bouin selama 6 sampai 24 jam. Selanjutnya larutan fiksatif tersebut dihilangkan dengan alkohol 70% hingga warna larutan fiksatif hilang.

Sebelum dilakukan pewarnaan terhadap embrio, sebelumnya dilakukan perendaman terlebih dahulu dengan mennggunakan larutan alkohol 50%, 30% masing- masing 0,5 jam, kemudian dilanjutkan dengan perendaman dengan larutan aquades selama 0,5 jam. Perendaman ini bertujuan untuk proses rehidrasi sel-sel embrio ayam. Pewarnaan terhadap embrio ayam menggunakan hematoxylin delafield selama 1 malam. Hematoxylin delafield ini merupakan salah satu pewarna alami untuk mewarna embrio ayam. Pewarna ini cukup kuat dan diencerkan di dalam aquades dengan perbandingan 1:1 dan 1:2. Dengan zat warna ini, maka embrio akan terwarnai. Selanjutnya setelah pewarnaan makan dilanjutkan dengan differensiasi untuk menampakkan anatomi tubuh embrio lebih jelas. Dalam pembuatan sediaan embrio ayam ini, proses dehidrasi dilakukan dengan mennggunakan alkohol 70%-asam. Setelah ini warna pewarna dilunturkan dengan dengan pencucian menggunakan air kran hingga warna menjadi biru.

Setelah pencucian, proses selanjutnya yaitu dehidrasi. Dehidrasi berarti pengambilan air dari dalam jaringan. Tahap ini merupakan tahap yang penting setelah jaringan atau objek mengalami fiksasi atau pencucian, karena larutan fiksatif dan larutan untuk pencucian banyak mengandung air. Pengambilan air ini perlu, karena masih adanya air dalam jaringan merupakan suatu penghalang bagi proses- proses selanjutnya. Untuk keperluan dehidrasi pada umumnya dipergunakan alkohol dengan kadar bertingkat dari onsentrasi yang lebih rendah berturut turut ke konsentrasi yang lebih tinggi. Dalam pembuatan sediaan embrio ayam menggunakan 4 tingkatan konsentrasi yaitu 50%, 70%, 95% dan 100%, masing- masing selama 10- 15 menit.  Jaringan embrio ayam bukan merupakan jaringan yang keras dan berkayu sehingga waktu yang dibutuhkan untuk proses dehidrasi ini tidak terlalu lama.

Setelah proses dehidrasi selesai maka dilakukan proses penjernihan. Sebelumnya kita perlu melepaskan terlebih dari kertas saring yang meekat pada embrio baru kemudian dilakukan penjernihan. Penjernihan ini bermaksud untuk menghilangkan alkohol dari dalam jaringan setelah mengalami dehidrasi dengan alkohol. Menurut Gray, lautan penjernih yang baik untuk membuat sediaan untuh (whole mount) adalaj terpinol (minyak esensial dari tanaman lilac).Zat ini lebih cepat bercampur dengan alkohol 90% dan baunya tidak merangsang serta tidak merusak jaringan.

Adapun proses terakhir setelah penjernihan yaitu proses mounting. Mounting ialah meletakkan zat perekat di antara kaca benda dan kaca penutup sehingga obyek atau irisan tnggal tetap, permanen di dalamnya dan dalam keadaan transparan, untuk pemeriksaan di bawah mikroskop. Zat perekat (mounting media/ mountant) yang digunakan adalah jenis zat perekat yang daat bercampur dengan air yaitu balsam. Balsam merupakan larutan dari suatu resin dalam terpentin dan mengandung sederetan hidrokarbon yang bertitik didih tinggi sebagai penjaga plastisitas balsam bila mengering. Dengan demikian embrio ayam telah dapat diamati dalam bentuk sediaan utuh (whole mounting).